纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚丙交酯支架的体外生物相容性和成骨活性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.08.009

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (8): 1198-1204.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.08.009

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纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚丙交酯支架的体外生物相容性和成骨活性

王菲¹，周洪¹，郭昱成¹，苏晓霞¹，饶国洲¹，赵小鹏²

1西安交通大学附属口腔医院正畸科，陕西省西安市 710004；2中国兵器工业第二零五研究所职工医院，陕西省西安市 710061

收稿日期:2013-12-03 出版日期:2014-02-19 发布日期:2014-02-19
通讯作者: 周洪，教授，西安交通大学附属口腔医院，陕西省西安市 710004
作者简介:王菲，女，1975年生，汉族，山东省德州市人，2003年西安交通大学毕业，硕士，主治医师，主要从事组织工程研究。
基金资助:
陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项计划项目的支持(2008ZDKG-65)

Biocompatibility and osteoinductive activity of nano-hydroxyapatite/chitosan/ poly(lactide-co-glycolide) scaffolds in vitro

Wang Fei¹, Zhou Hong¹, Guo Yu-cheng¹, Su Xiao-xia¹, Rao Guo-zhou¹, Zhao Xiao-peng²

1Department of Orthodontics, Hospital of Dentistry, Xi’an Jiaotong University, Xi’ an 710004, Shaanxi Province, China; 2the Hospital of the 205 Research Institute of Weapons Industry in China, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China

Received:2013-12-03 Online:2014-02-19 Published:2014-02-19
Contact: Zhou Hong, Professor, Department of Orthodontics, Hospital of Dentistry, Xi’an Jiaotong University, Xi’ an 710004, Shaanxi Province, China
About author:Wang Fei, Master, Attending physician, Department of Orthodontics, Hospital of Dentistry, Xi’an Jiaotong University, Xi’ an 710004, Shaanxi Province, China
Supported by:
the Major Specific Plan of “13115” Scientific Innovative Engineering Program of Shaanxi Province, No. 2008ZDKG-65

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现将聚丙交酯、纳米羟基磷灰石或聚丙交酯两两复合后可在一定程度上改善支架的机械性能、生物相容性和对细胞的成骨诱导分化，但离理想的骨组织工程支架材料尚有一定的距离。
目的：对比不同配比纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚丙交酯支架的体外生物相容性及生物活性。
方法：采用粒子沥滤法制备纳米羟基磷灰石、壳聚糖、聚丙交酯的质量比分别为10∶10∶80、10∶20∶70、20∶10∶70的复合支架。将3组复合支架与人骨髓间充质干细胞进行体外复合培养，绘制细胞在支架上的生长曲线，以RT-PCR检测细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素的表达。
结果与结论：配比为20∶10∶70复合支架的细胞黏附率明显高于其他两复合支架组(P < 0.01)，并且复合培养9-27 d的细胞碱性磷酸酶活性、复合培养15-27 d的骨钙素表达明显高于其他两复合支架组(P < 0.01)，3组细胞的增殖趋势相似。说明配比为20∶10∶70的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚丙交酯支架具有良好的生物相容性及骨诱导活性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚丙交酯支架, 骨髓间充质干细胞, 组织工程, 碱性磷酸酶

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that combination of two of chitosan (CS), nano-hydroxyapatite (nHA) and poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) can improve the mechanical properties and biocompatibility of the composite stent in certain extent as well as improve osteogenic differentiation of the cells, but there is a certain distance from the ideal bone tissue engineering scaffolds.
OBJECTIVE: To study biocompatibility and osteoinductive activity of nHA/CS/PLGA scaffolds with different proportions in vitro.
METHODS: nHA/CS/PLGA scaffolds were prepared at mass ratio of 10:10:80, 10:20:70, 20:10:70 respectively by particle leaching method. And human bone marrow stem cells (hBMSCs) were co-cultured with these scaffolds in vitro. Adhesion, proliferation, and osteoinductive activity of these scaffolds were examined qualitatively and quantitatively by growth curve of hBMSCs on scaffolds. Gene expression of alkaline phosphatase activity and osteocalcin was detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: hBMSCs could be attached, proliferated, and osteoinduced better on the nHA/CS/PLGA scaffold with the mass ratio of 20:10:70, compared to the other two groups of scaffolds. The differences were significant statistically (P < 0.05). Alkaline phosphatase and osteocalcin expressions were respectively higher in the scaffold with the mass ratio of 20:10:70 after 9-27 days of co-culture and 15-27 days of co-culture, in comparison with the other two groups of scaffolds. These findings indicate that the nHA/CS/PLGA scaffolds with the mass ratio of 20:10:70 demonstrated preferable biocompatibility and osteogenic inductivity, which is expected to be a promising scaffold material for bone tissue engineering.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

Key words: biocompatible materials, nanoparticles, chitosan, hydroxyapatites

中图分类号:

R318

王菲，周洪，郭昱成，苏晓霞，饶国洲，赵小鹏. 纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚丙交酯支架的体外生物相容性和成骨活性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(8): 1198-1204.

Wang Fei, Zhou Hong, Guo Yu-cheng, Su Xiao-xia, Rao Guo-zhou, Zhao Xiao-peng. Biocompatibility and osteoinductive activity of nano-hydroxyapatite/chitosan/ poly(lactide-co-glycolide) scaffolds in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(8): 1198-1204.

图/表（结果） 4

2.1 支架外观及孔隙率的测定 3种支架均为乳白色，内部及表面充满多孔状结构。应用排水法测量3种支架孔隙率均大于80%。扫描电镜可以观察到纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚丙交酯支架孔表面均匀分布有纳米羟基磷灰石及壳聚糖颗粒，3组支架内部孔结构没有明显差异；3种支架孔径分布均以100-300 µm为主，其间散在分布有30-50 µm不等的微孔(图1)。采用Digmizer图像测量软件测量3组复合支架孔隙的平均孔径分别为(224.14±86.47)，(221.14±23.10)，(226.19±47.35) µm，结果没有统计学差异，孔径大小均符合引导骨生长的支架最佳孔径。10∶10∶80、10∶20∶70组及20∶10∶70组支架抗压缩实验测试结果分别为(6.078±0.111)，(4.586 ±0.159)，(10.898±0.119) MPa，显示3组支架的抗压强度均与人平均松质骨抗压强度0.5-11.0 MPa相当^[12]。而20∶10∶70组支架抗压强度明显大于其他两组(P < 0.01)。

2.2 人骨髓间充质干细胞与支架复合后的体外实验

细胞在支架上的黏附率及生长曲线：细胞复合 20∶10∶70支架组在第1天的黏附率及之后各个时间点测定的细胞增殖率均显著高于10∶10∶80组及10∶20∶70组(P < 0.01)，见表1。3组支架的细胞增殖趋势相似，第1-3天为潜伏期，第3天进入对数增殖期，第9天后基本进入平台期(图2)。

RT-PCR检测细胞碱性磷酸酶及骨钙素基因表达：3组支架细胞复合物在成骨诱导液中培养21 d后，20∶10∶70组细胞碱性磷酸酶及骨钙素的表达均强于10∶10∶80组、10∶20∶70组(P < 0.01，图3)。碱性磷酸酶活性及骨钙素含量的定量检测：细胞复合3组支架后碱性磷酸酶A值在第15天达到高峰后均开始下降，20∶10∶70组细胞碱性磷酸酶A值在第9天后显著高于其他两组(P < 0.01)；细胞复合3组支架的骨钙素值在第21天达到高峰后均开始下降，20∶10∶70组细胞的骨钙素值在第15天后显著高于其他两组(P < 0.01，图4)。

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引言

近年来骨组织工程技术在整形、颌面外科等相关学科领域得以应用和发展，为骨缺损修复提供了全新的思路和方法^[1]。组织工程中支架材料是种子细胞附着的基本框架和代谢场所，是骨组织工程能否发展与运用于临床的关键^[2-4]，因此理想的支架材料对于骨组织工程学发展和应用至关重要。聚丙交酯^[5-6]、壳聚糖^[7-8]、纳米羟基磷灰石是目前常用的几种组织工程材料^[9-10]。

聚丙交酯为人工合成聚乳酸与聚羟基乙酸的共聚物，具有生物相容性、无毒性，分子质量可通过控制其中两种物质的比例得到调控，并由此调节聚合物降解速率。在体内聚丙交酯可通过酯键水解断链降解，而后通过三羧酸循环降解为乳酸和羟基乙酸，参与人体的新陈代谢，最终成为CO₂和H₂O排出体外。聚丙交酯组织相容性好，可通过改变共聚物的摩尔比率获得预期的药物释放时间；热塑性较强、强度较高，具有支架和缓释载体双重作用，已被美国FDA批准用于生物医用材料、药用辅料等，如：外科手术缝合线、人工关节、骨科内固定板、骨螺钉、药物缓释控释制剂载体。但聚丙交酯机械强度不足，也缺乏骨诱导性，因此单纯聚丙交酯的应用受到一定限制。

壳聚糖是自然界中少见的一种带正电荷含有游离氨基的碱性多糖，是甲壳素的脱乙酰化产物。甲壳素分布广泛，在昆虫、甲壳纲动物外壳及真菌的细胞壁中大量存在，是仅次于纤维素的第二大可再生资源，因此可以说其来源很丰富。壳聚糖化学名为B-(1，4)-2-氨基-2-脱氧氨基-D-葡萄糖，其内部的共价键结合高分子直链后类似纤维结构，具有很强的吸附性，利于细胞黏附增殖及分化。壳聚糖在体内显示出无聚集、无免疫原性、无毒性、无刺激性，生物相容性好，其降解产物为葡萄糖胺，有一定的碱性，可降解，可完全被人体吸收。壳聚糖中的羟基使其具备醇的性质，氨基使其易于化学改性。目前已知壳聚糖及其衍生物具有抗微生物、增强免疫、调节血脂、抑制肿瘤等生物学活性，具有可降解性和组织相容性，经降解和化学修饰后的壳聚糖具有更好的生物活性。壳聚糖及其降解物和修饰物安全性良好，作为细胞、生长因子的载体和支架材料已被用于组织工程中，作为药物控释、毒物吸附分离剂、术后防粘连膜、透析膜、载药微球、骨科齿科修复材料等在生物医学中也被广泛的应用。

羟基磷灰石是人骨骼中无机成分之一，分子式为Ca₁₀ (PO₄)₆(OH)₂，而人工合成的羟基磷灰石具有良好的生物亲和性、生物相容性、生物活性和骨传导作用，可作为一种优良的硬组织替代材料。但由于羟基磷灰石脆性大、韧性低，不能用于负重部位骨缺损的修复，也不容易降解，这些缺点限制了其作为人体材料种植体的使用。近年来，直径为1-100 nm的纳米羟基磷灰石具有相对于普通羟基磷灰石更高的溶解度、更大的表面能及更强的吸附性，显示出了更好的生物活性，小粒径的羟基磷灰石对提高复合材料的力学性能有利，粒子粒径越小其表面积越大，表面能越高，与其他材料之间的界面结合就越紧密。自20世纪90年代后对纳米羟基磷灰石的研究获得了很大进展，但以纳米羟基磷灰石作为单一成分的人工骨仍然不能满足临床的要求。虽然骨骼本身是主要由纳米级羟基磷灰石结晶分散在骨胶原骨架中组成的、一种具有很高韧性和硬度的天然纳米复合材料，但骨胶原和纳米羟基磷灰石本身都不能作为支架的结构材料，因此不能单独作为支架材料应用于组织工程骨中。

鉴于单纯的聚丙交酯、壳聚糖、纳米羟基磷灰石在组织工程骨中应用具有一定的局限性，实验将这3种材料结合起来，利用粒子沥滤法制备纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚丙交酯支架，检测不同配比的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚丙交酯支架与人骨髓间充质干细胞复合后的细胞相容性、成骨活性差异，评价不同配比的复合支架在骨组织工程中应用的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：对比观察细胞学实验。

时间及地点：于2012年6至12月在西安交通大学口腔医院医学中心完成。

材料：

不同配比复合支架体外生物相容性和成骨活性对比实验的主要材料及试剂：
材料及试剂	来源
纳米羟基磷灰石(40 nm粉体)	南京埃普瑞纳米材料有限公司
壳聚糖(黏均分子质量5.95×10⁵，脱乙酰度85%)	浙江金壳生物化学有限公司
聚丙交酯(聚乳酸∶聚羟基乙酸为 80∶20，相对分子质量2.5×10⁵)	济南岱罡生物科技有限公司
DMEM培养基、胰蛋白酶	海克隆生物化学制品有限公司，北京
胎牛血清	Gibco公司，美国
地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、青霉素和链霉素	江西东风药业股份有限公司
苯酚和二甲基亚砜	西安化学试剂厂
碱性磷酸酶试剂盒及骨钙素放免试剂盒	北京东亚免疫技术研究所

实验方法：

聚丙交酯/纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架的制备及孔隙率测定：采用粒子虑粒法制备纳米羟基磷灰石、壳聚糖及聚丙交酯的质量比分别为10∶10∶80，10∶20∶70， 20∶10∶70的复合支架^[8-9]。取一定量的聚丙交酯溶于氯仿中，配成10%的溶液，待聚丙交酯完全溶解后，加入纳米羟基磷灰石和壳聚糖，之后进行充分搅拌，使两者均匀分散在聚丙交酯氯仿溶液中，再加入经研磨过筛150-250 µm粒径的氯化钠，加入氯化钠量为总体积的10%。充分搅拌混匀后，超声脱泡，浇注于聚四氟乙烯模具中，浇注后静置24-48 h，脱模后再静置24-48 h，然后在真空干燥箱中室温真空干燥24 h。排水法测定孔隙率，每种支架各测5次，取平均值。

扫描电镜观察复合支架及测定抗压强度：复合支架样品的自然断面经离子溅射仪喷金镀膜后，用扫描电镜观察支架的孔结构，万能材料试验机测定支架材料的抗压强度。

人骨髓间充质干细胞的培养^[10]：细胞在西安交通大学口腔医院中心实验室获得，分离培养过程为：采集健康志愿者髂骨内骨髓15 mL，加等量PBS(pH 7.2)混匀，室温下1 200 r/min离心10 min，离心半径15 cm，弃上清，连续用PBS洗二三次；以2×10¹² L^-1浓度将细胞种入含体积分数10%FBS、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL的DMEM培养基，37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱中培养；5 d后首次换液，之后每周2次更换培养液，待细胞达到70%-80%融合时，用1∶1的0.125%胰蛋白酶和2.0 g/L EDTA混合液消化后传代。光学显微镜观察细胞形态主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。将第3代细胞用流式细胞仪鉴定细胞表面标志及成骨、成软骨、成脂肪检测，结果显示细胞阳性表达CD166、CD44、CD105、和CD29等基质细胞和间质细胞的特异性表面标志；不表达造血干、祖细胞及内皮细胞的表面标志CD34；不表达白细胞表面标志CD45；不表达抗原呈递细胞及成纤维细胞表面标志HLA-DR。细胞经成骨、成软骨、成脂肪诱导21 d后，经特征性染色可见细胞呈现多项分化的表现。

人骨髓间充质干细胞与支架复合后的体外实验：

细胞在支架上的生长检测：将支架修整为0.3 cm× 0.3 cm×0.5 cm大小，蒸馏水加压反复冲洗，去离子水超声清洗2次，30 min/次，⁶⁰Co照射消毒。3种支架各25个放入96孔培养板内，用DMEM培养液浸泡支架1 d后弃残液，用1 mL针管将0.2 mL浓度调整为1×10⁹ L^-1的P3代骨髓间充质干细胞的细胞悬液缓慢从各个角度注射入材料内部，于 37 ℃、体积分数5% CO₂饱和湿度条件下培养，8 h后补加1次培养基。

细胞计数法绘制细胞在支架上的生长曲线：分别在 1，3，5，7，9，13，15 d取每种支架材料5个，PBS冲洗2次，0.125%胰蛋白酶消化，使黏附在支架上的细胞脱落，细胞计数板进行计数，计算细胞黏附率及增殖情况并做统计分析。细胞黏附率(%)=贴壁细胞数/接种细胞数×100%，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制各组细胞生长曲线。

成骨诱导条件下细胞在支架上的成骨转化检测：①半定量RT-PCR比较碱性磷酸酶、骨钙素基因表达：在成骨诱导条件下(成骨诱导液成分:含体积分数10%FBS的DMEM培养基，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，0.05 mmol/L维生素C，100 mmol/L地塞米松)，将骨髓间充质干细胞与支架复合成骨诱导3周后，Trizol法提取总RNA行RT-PCR检测，观察成骨特异性基因碱性磷酸酶、骨钙素表达情况，以β-actin作为内参。电泳扫描后，计算目的基因相对于β-actin灰度比值，进行统计学分析(n=4)。引物设计及基因扩增片段参考文献[11]。②碱性磷酸酶活性及骨钙素含量的定量检测：分别将0.2 mL浓度为1×10¹¹ L^-1的P3代骨髓间充质干细胞滴加于3组支架材料上，成骨诱导液换液，于细胞接种后3，9，15，21，27 d吸取各孔培养液上清，分别使用碱性磷酸酶试剂盒及骨钙素放免试剂盒检测，其中酶联免疫检测仪在490 nm波长下测定吸光度(A值)(n=6)；¹²⁵I标记骨钙素，样品所含骨钙素与骨钙素抗体竞争结合，使用分离剂使结合抗体沉淀，4 ℃离心后，γ计数器测定沉淀物每分钟计数数值，根据准品曲线得到样品骨钙素含量(n=6)。

主要观察指标：3组复合支架与人骨髓间充质干细胞复合培养后的细胞生长及细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素表达。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，以单因素方差分析进行显著性检验， P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

壳聚糖是由甲壳素部分脱乙酰化得到的天然有机高分子材料，具有促进骨细胞和成纤维细胞黏附、分化和增殖，引导和促进骨形成的作用。但壳聚糖存在强度低和在湿态环境下强度损失过快的问题^[13-14]。羟基磷灰石是人骨无机质的主要成分，而纳米级羟基磷灰石是近年来研制出无机生物活性材料，尺寸小，具有更好生物学活性^[9-10]。聚丙交酯是目前应用和研究较广泛的具有一定可塑性及生物相容性的人工合成可降解聚合物^[6,15-20]。聚丙交酯结构和亲、疏水性可以通过聚乳酸、聚乙醇酸的不同比例进行调节。但聚丙交酯降解产物呈酸性，材料表面缺乏细胞识别信号，不利于细胞的黏附。因此，单一的聚丙交酯材料作为骨组织工程支架材料有很大的局限性。有学者将聚丙交酯复合纳米羟基磷灰石^[21-24]、聚丙交酯复合壳聚糖^[25]、壳聚糖复合纳米羟基磷灰石后，发现复合支架材料在机械性能、生物相容性和对细胞的成骨诱导分化方面有所改善，但离理想的骨组织工程支架材料尚有一定的距离^[26-27]。实验基于将上述3种材料组合后是否能更好的改善单纯材料的缺陷进行研究。多孔支架的制备是骨组织工程的重要环节，为了制备优良的聚合物多孔支架，近些年来已经探索出多种制备方法，主要包括粒子滤粒法^[28]、纤维网固定^[29]、冷冻干燥^[30]、

热诱导相分离和气体发泡等方法^[31]。其中利用纤维网固定法制备的支架结构稳性较差，在实际应用时容易发生变形、损坏；而冷冻干燥技术和热诱导相分离技术制备支架孔径太小，一般不超过100 µm，仅适用于制备微孔材料；气体发泡法形成的多孔支架则容易形成闭孔结构，孔隙连通性不足，难以使营养成分进入孔内，因此不能满足组织工程对开孔结构的要求。与以上方法不同，粒子沥滤法是将医用生物材料和致孔剂粒子先制成均匀的混合物，然后利用二者不同的溶解性或挥发性，将致孔剂粒子除去，致孔剂粒子除去后致孔剂粒子所占的空间变成孔隙，从而制成多孔支架。采用氯化钠等可溶性粒子作造孔剂的粒子滤粒法，优点是可得到具有连通孔隙的多孔支架，且孔隙大小及结构可以通过调控造孔剂颗粒的大小和加入量来调节，并且制备设备也相对简单，成本较低，基于此实验采用了此法制备支架。

在实验中人工合成生物高分子材料聚丙交酯、人工合成无机纳米材料纳米羟基磷灰石与天然生物可降解聚合物壳聚糖被复合在一起，制备了纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚丙交酯支架。在复合支架的3种成分中聚丙交酯的比例占绝对优势，使支架在形成过程中可以聚丙交酯为模板更好的控制支架的结构，同时指导纳米羟基磷灰石、壳聚糖的沉积。

实验制备的复合支架在孔径、孔隙率、抗压缩强度方面均可满足骨组织工程骨对支架的要求^[32]，通过内部3种成分比例的不同对比，发现质量比为20∶10∶70的复合支架对人骨髓间充质干细胞的黏附率和增殖率明显提高。提示当纳米羟基磷灰石含量适当提高时支架材料具有更好的生物学特性，更有利于细胞的黏附及增殖。壳聚糖是带正电荷含有游离氨基的碱性多糖，具有吸附带负电荷细胞的能力，对细胞有较强的吸附功能；而纳米羟基磷灰石具有溶解度较高、表面能较大的优点，增大的表面积更有利于细胞的黏附。但关于这两种材料在对细胞黏附性的比较研究尚未有文献报道。至于实验结果提示当纳米羟基磷灰石、壳聚糖总体含量不变的情况下，纳米羟基磷灰石含量适当提高时细胞黏附性增加的机制仍需进一步研究，也可能还与纳米羟基磷灰石、壳聚糖比例的变化改变了纳米羟基磷灰石、壳聚糖和聚丙交酯3者对特定细胞的相互协同关系有关。

碱性磷酸酶是一种膜结合酶，其活性的高低可反映成骨细胞，特别是新形成的成骨细胞活性及状态；在成骨细胞分化早期表达，标志着成骨细胞分化的开始，被认为是细胞外基质成熟的早期标志。碱性磷酸酶的活性可以代表成骨细胞的早期分化水平，当细胞进入钙化期后，细胞内碱性磷酸酶活性开始下降^[33-34]。骨钙素由成骨细胞合成并分泌，也是反映骨形成的特异指标^[35-39]。骨钙素的分泌可增加骨细胞的矿化速度，促进骨钙盐沉积，所以只有在成骨细胞的矿化期，骨钙素才有表达^[40]。实验3组支架均具有使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化的功能，分化后的成骨细胞分泌碱性磷酸酶和钙盐结晶体至细胞外基质中，碱性磷酸酶在细胞外基质中使局部磷酸含量增高，促使基质矿化。随着成骨细胞分化成熟进入矿化期，细胞外基质到成熟后期，碱性磷酸酶活性均开始降低，而骨钙素此时开始表达并逐渐增强。3组支架中质量比为20∶10∶70的复合支架在碱性磷酸酶、骨钙素表达和定量检测方面均表现出明显增加，表明质量比为20∶10∶70的复合支架具有更强促骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化的功能。提示当纳米羟基磷灰石、壳聚糖、聚丙交酯比例为20∶10∶70时复合支架增加了对骨髓间充质干细胞黏附增殖能力的同时，在成骨诱导条件下促进了骨髓间充质干细胞的成骨分化，即增加了3种材料对成骨的协同效应。

实验发现纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚丙交酯支架材料表现出良好的生物相容性和生物活性，应该与其含有的3种材料特性有关，纳米羟基磷灰石、聚丙交酯为人工合成材料，纳米羟基磷灰石可提高基础材料的机械强度，延长初始强度的维持时间，同时纳米级的结构具有超强的表面活性；聚丙交酯可以设计和控制材料的机械性能、降解速度和降解时间；壳聚糖为天然生物材料，生物相容性好，具有细胞识别信号，利于细胞黏附增殖。因此将这3种材料复合，相当于将3种材料的优势结合起来，即是将良好的机械强度、可控的材料降解速度、较强的细胞黏附增殖性结合起来。实验发现当纳米羟基磷灰石:壳聚糖:聚丙交酯质量比为20∶10∶70时，支架具有较强的生物活性和成骨诱导性。实验认为纳米羟基磷灰石、壳聚糖均具有较好的生物活性，但纳米羟基磷灰石是利用其纳米级粒径的表面活性，而壳聚糖主要是依靠其分子结构对细胞的黏附特性，因此可以推断可能纳米羟基磷灰石粒径的表面活性占有更强的优势。关于壳聚糖、纳米羟基磷灰石生物活性的比较和协同效应的机制研究未见文献报道。

Wu等^[25]提出壳聚糖对成骨细胞的分化有利，其在多孔聚丙交酯支架上涂布壳聚糖，促进了支架对成骨细胞的分化。Ito^[41]将壳聚糖与羟基磷灰石复合，增强了骨再生性能及骨传导性，证明了壳聚糖与羟基磷灰石在改善材料的生物学活性方面具有协同作用。但关于壳聚糖、纳米羟基磷灰石的配比对发挥其协同效应的影响未涉及。因此，关于这3种材料在成骨方面的协同机制及在动物体内的成骨效果有待于进一步的研究。

纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚丙交酯支架材料对人骨髓间充质干细胞有很好的黏附性和增殖性，而且表现出了良好的成骨转化能力，质量比为20∶10∶70的支架材料在骨组织工程中具有很强的研究价值。

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实验发现纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚丙交酯支架材料表现出良好的生物相容性和生物活性，应该与其含有的3种材料特性有关，纳米羟基磷灰石、聚丙交酯为人工合成材料，纳米羟基磷灰石可提高基础材料的机械强度，延长初始强度的维持时间，同时纳米级的结构具有超强的表面活性；聚丙交酯可以设计和控制材料的机械性能、降解速度和降解时间；壳聚糖为天然生物材料，生物相容性好，具有细胞识别信号，利于细胞黏附增殖。因此将这3种材料复合，相当于将3种材料的优势结合起来，即是将良好的机械强度、可控的材料降解速度、较强的细胞黏附增殖性结合起来。实验发现当纳米羟基磷灰石:壳聚糖:聚丙交酯质量比为20:10:70时，支架具有较强的生物活性和成骨诱导性。实验认为纳米羟基磷灰石、壳聚糖均具有较好的生物活性，但纳米羟基磷灰石是利用其纳米级粒径的表面活性，而壳聚糖主要是依靠其分子结构对细胞的黏附特性，因此可以推断可能纳米羟基磷灰石粒径的表面活性占有更强的优势。关于壳聚糖、纳米羟基磷灰石生物活性的比较和协同效应的机制研究未见文献报道。Wu等^[提出壳聚糖对成骨细胞的分化有利，其在多孔聚丙交酯支架上涂布壳聚糖，促进了支架对成骨细胞的分化。Ito等将壳聚糖与羟基磷灰石复合，增强了骨再生性能及骨传导性，证明了壳聚糖与羟基磷灰石在改善材料的生物学活性方面具有协同作用。但关于壳聚糖、纳米羟基磷灰石的配比对发挥其协同效应的影响未涉及。因此，关于这3种材料在成骨方面的协同机制及在动物体内的成骨效果有待于进一步的研究。

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纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚丙交酯支架的体外生物相容性和成骨活性

Biocompatibility and osteoinductive activity of nano-hydroxyapatite/chitosan/ poly(lactide-co-glycolide) scaffolds in vitro

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